Пцр тест для чего создан
Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!
Роспотребнадзор (стенд)
Роспотребнадзор (стенд)
ПЦР – диагностика. Просто о сложном
ПЦР – диагностика. Просто о сложном
С чего она начиналась. Конечно, с предшествующих открытий ДНК, принципа комплементарности, составляющих её аминокослот и использования фермента полимеразы для увеличения количества фрагментов лизированной ДНК.
Что такое – ПЦР – диагностика? ПЦР – это полимеразная цепная реакция. Из названия становится ясно, что основной компонент реакции – фермент полимераза, причем необходима термоустойчивая разновидность. Цепная реакция – это потому, что протекает она по типу ядерной реакции. В короткое время обеспечивается увеличение количества определяемой нуклеиновой кислоты в 2-4-8-16 и т. д. раз в геометрической прогрессии…
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR)изобрёл в 1983 году американский учёный Кэри Мюллис, работавший в области молекулярной биологии над созданием прибора под названием амплификатор.
Интересны обстоятельства, при которых у него появилась эта идея. Вот как это было… Открытию предшествовали размышления исследователя о проблеме разрушения обычной полимеразы в процессе воздействия высоких температур (до 95 град. С). В тёплую лунную майскую ночь биолог возвращался со своей дамой с дружеской вечеринки, девушка спала на заднем сидении кабриолета… Кэрри Мюллис вёл машину по пустынной дороге, освещенной лунным светом. И вот при таких романтических обстоятельствах у него появилась идея использовать полимеразу термоустойчивых бактерий, обитающих в термальных источниках!
В 1993 г. за воплощение в лабораторную практику молекулярной биологии этого изобретения он получил Нобелевскую премию.
В настоящее время ПЦР-диагностика является одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний, наследственных патологий, определения генетически модифицированных продуктов, идентичности биологического материала, в том числе в судебной практике.
ПЦР – диагностика стала необходимым элементом при постановке диагноза вирусных гепатитов В и С, назначении лечения интерферонами и его корректировке по дозам и срокам специфического лечения.
Различают методы ПЦР: с учётом по конечной точке методом электрофореза, флюоресцентной детекции на приборах «АЛА 1\4» (Латвия), «Джин» ( Россия), полуколичественный метод, и самый современный метод – в режиме реального времени с использованием надёжного специального оборудования.
Эпидемии гриппа А Н1N1 (Калифорния 09) 2009 г. и прошедшего эпидсезона 2015-2016 годов показали, что Роспотребнадзор по Республике Дагестан успешно справился с задачей диагностики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций у больных с тяжёлыми формами респираторной патологии.
ПЦР – диагностика с помощью мультиплексных тест-систем (на несколько инфекций) с успехом используется не только в диагностике ОРВИ, пневмоний, менингитов, а также для расшифровки вспышек пищевых токсикоинфекций, как на бактерии, так и на вирусы.
Диагностика инфекций методом ПЦР: что это такое?
Перечень анализов, проводимых при помощи ПЦР-диагностики расширяется с каждым днём. Что это за метод, как его проводят и в чём его достоинства? На эти и другие вопросы отвечает Владислав Александрович Чередниченко, врач-инфекционист, заместитель директора по развитию «Клиника Эксперт» Воронеж.
— Владислав Александрович, ПЦР – что это такое?
ПЦР или, иначе, полимеразная цепная реакция – это современный высокоинформативный метод молекулярно-генетической диагностики, активно применяемый для выявления у человека различных инфекционных и наследственных заболеваний.
За создание метода ПЦР американский биохимик Кэри Муллис был удостоен Нобелевской премии
— Как давно появилась ПЦР-диагностика и насколько она распространена сегодня?
Кэри Муллис
Сегодня без ПЦР-диагностики в клинической медицине практически невозможно обойтись. Высочайшая чувствительность метода позволяет опираться на него при выявлении различных инфекционных агентов в разных аспектах － как в качественном (возбудитель есть или нет), так и в количественном (какое количество микроорганизмов).
Помимо медицины метод нашёл применение в генетике, криминалистике, археологии.
— Для выявления каких заболеваний назначают проведение ПЦР?
Универсальность метода позволяет применять его для диагностики большинства патологий вирусной, бактериальной, грибковой природы, а также вызываемых гельминтами и простейшими. Например, метод ПЦР активно используется для выявления таких болезней инфекционной природы, как ВИЧ, гепатиты всех видов, уреаплазмоз, хламидиоз, микоплазмоз, кандидоз, мононуклеоз, трихомониаз, герпетические инфекции, сальмонеллёз, туберкулёз и многие другие.
Читайте материалы по теме:
— Какой биологический материал исследуют при ПЦР-диагностике?
Все биологические среды и жидкости человека: кровь, мочу, кал, мокроту, слюну, сок простаты, сперму, спинномозговую и суставную жидкость, и другие. Выбор биологического материала зависит от локализации возбудителя. К примеру, для проведения ПЦР на обнаружение хламидии, уреаплазмы или герпеса используют соскобы со слизистых оболочек, для выполнения ПЦР на гепатиты А, В, С и др. требуется кровь, а ПЦР-анализ на выявление туберкулёза лёгких будет максимально информативным при исследовании мокроты пациента. Использование метода полимеразной цепной реакции при изучении биоптатов из органов желудочно-кишечного тракта позволяет обнаружить хеликобактерную инфекцию.
— Как проводится процедура ПЦР? В чём её суть?
Суть ПЦР в том, что берётся малое количество ДНК или РНК-содержащего материала для исследования, а реакция способствует увеличению количества генетического материала, принадлежащего конкретному возбудителю, поэтому становится возможным его идентификация.
Пациента обычно отправляет на ПЦР-диагностику лечащий врач. В процедурном кабинете или в кабинете специалиста у пациента берут необходимый биоматериал, который упаковывается с соблюдением условий стерильности, температурного режима и маркировки. Затем биоматериал отправляют в ПЦР-лабораторию, где помещают в специальный аппарат, в котором происходит три этапа трансформации биоматериала.
Через 1-2 дня пациент получает результаты исследования.
— Требуется ли для проведения ПЦР-исследования специальная подготовка?
Нет, но рекомендуется придерживаться некоторых правил. Кровь для анализа сдают натощак. Слюну, мокроту, мочу и кал собирают в чистую посуду. Перед сдачей материала из половых путей для диагностики заболеваний мочеполовой системы следует на протяжении двух суток воздержаться от половой жизни. Также целесообразно перед исследованием уточнять особенности подготовки в лечебном учреждении либо в лаборатории.
А как готовиться к другим распространённым анализам? Об этом и не только читайте ниже:
— Владислав Александрович, расскажите о преимуществах и недостатках данного метода исследования.
Недостатков у ПЦР-диагностики при условии строгого соблюдения технологии проведения анализа и чистоты материала, на мой взгляд, нет.
Главным достоинством данного метода является его высокая чувствительность и возможность обнаружения самого возбудителя как в качественном, так и в количественном отношении. Определение количества микроорганизмов служит хорошим подспорьем для лечащего врача, так как позволяет оценить степень поражения, а также эффективность проводимого лечения.
Бесспорным преимуществом ПЦР-диагностики является также пригодность различных видов биологического материала пациента: крови, мочи, кала, спермы и т.д. В одном образце материала можно обнаружить нескольких возбудителей. К плюсам ПЦР-диагностики я бы отнёс и то, что это аппаратная методика, практически исключающая субъективизм в оценивании биологического материала.
Беседовала Севиля Ибраимова
Редакция также рекомендует:
Для справки:
Чередниченко Владислав Александрович
В 2000 году закончил Донецкий государственный медицинский университет им М. Горького по специальности «Лечебное дело».
В 2002 году закончил магистратуру в Украинской военно-медицинской академии (г. Киев) по специальности «врач-инфекционист».
Заместитель медицинского директора по развитию региона в «Клиника Эксперт» Воронеж. Принимает по адресу: ул. Пушкинская, д. 11.
Изобретатель ПЦР Кэри Муллис о бесполезности ПЦР в обнаружения инфекции (1 фото + 2 видео)
Хотя весь мир полагается на RT-PCR (ПЦР) для «диагностики» инфекции Sars-Cov-2, науке уже давно было известно, что ПЦР не подходят для этой цели.
Блокировки и санитарные-эпидемиологические меры во всем мире основаны на количестве случаев и показателях смертности, созданных с помощью так называемых тестов SARS-CoV-2 RT-PCR, используемых для выявления «положительных» пациентов, при этом «положительный» обычно приравнивается к «инфицированному», что в корне неверно и преступно.
Но если внимательно присмотреться к фактам, то можно сделать вывод, что эти ПЦР-тесты не имеют смысла в качестве диагностического инструмента для определения предполагаемой инфекции предположительно новым вирусом под названием SARS-CoV-2.
НЕОБОСНОВАННАЯ МАНТРА «Тестирование, Тестирование, Тестирование…»
На брифинге для СМИ по COVID-19 16 марта 2020 генеральный директор ВОЗ Тедрос Адханом Гебрейесус сказал:
«У нас есть простое послание для всех стран: тестируйте, тестируйте, тестируйте»
Еще 3 мая модератор журнала Heute — одного из самых важных новостных журналов на немецком телевидении — передавал своей аудитории мантру этой догмы:
» Тестировать, тестировать, тестировать — это кредо на данный момент, и это единственный способ действительно понять, насколько быстро распространяется коронавирус»
Это указывает на то, что вера в достоверность тестов ПЦР настолько сильна, что соответствует религии, которая практически не терпит противоречий.
Итак, для начала, очень примечательно, что сам Кэри Муллис, изобретатель технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР), говорил, что ПЦР не подходит для диагностики инфекции. Хотя его изобретение принесло ему Нобелевскую премию по химии в 1993 году.
К сожалению, Муллис скончался в прошлом году в возрасте 74 лет, но нет никаких сомнений в том, что его не стало т.к. он считал ПЦР непригодным для выявления вирусной инфекции.
Причина в том, что предполагаемое использование ПЦР было и остается применением в качестве производственного метода, позволяющего воспроизводить последовательности ДНК миллионы и миллиарды раз, а не в качестве диагностического инструмента для обнаружения вирусов.
ПЦР — хорошо подходит для установления отцовства, а также для поимки преступников, т.е. в криминалистики.
Как объявление вирусных пандемий на основе тестов ПЦР может закончиться катастрофой, описала Джина Колата в своей статье в New York Times 2007 года « Вера в быстрое тестирование ведет к эпидемии, которой не было»
ОТСУТСТВИЕ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ЗОЛОТОГО СТАНДАРТА
Более того, стоит упомянуть, что тесты ПЦР, используемые для выявления так называемых пациентов с COVID-19, предположительно инфицированных так называемым SARS-CoV-2, не имеют действующего золотого стандарта для их сравнения.
Это принципиальный момент. Тесты необходимо оценивать, чтобы определить их точность, строго говоря, их «чувствительность» и «специфичность» — путем сравнения с «золотым стандартом», то есть наиболее точным из доступных методов.
Если бы у нас был новый тест на обнаружение [бактерии] золотистого стафилококка в крови, у нас уже были посевы крови на питательных средах, это наш золотой стандарт, который мы использовали в течение десятилетий, и мы могли бы сопоставить этот новый тест с этим. Но для COVID-19 у нас нет золотого стандарта.
Но вместо того, чтобы классифицировать тесты как непригодные для обнаружения SARS-CoV-2 и диагностики COVID-19 или вместо того, чтобы указывать на то, что только вирус, подтвержденный путем выделения и очистки (изоляция вируса), может быть твердым золотым стандартом, ВОЗ со всей серьезностью заявляет, сам анализ ПЦР, «может быть лучшим доступным «золотым стандартом »». Но это не научно обосновано.
НЕТ ДОКАЗАТЕЛЬСТВ ВИРУСНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ РНК
Теперь вопрос: что требуется в первую очередь для изоляции / доказательства существования вируса?
Нам нужно знать, откуда берется РНК, для которой калибруются тесты ПЦР.
В качестве учебников (например, White / Fenner. Medical Virology, 1986), а также от ведущих исследователей вирусов, таких как Люк Монтанье или Доминик Дуайер, очистка частиц — то есть отделение объекта от всего остального, что не является этим объектом вируса, как, например, лауреат Нобелевской премии Мария Кюри в 1898 году очистила 100 мг хлорида радия, извлекая его из тонн урана — это необходимое предварительное условие для доказательства существования вируса, таким образом, доказательства того, что РНК рассматриваемой частицы исходит от нового вируса.
Причина этого в том, что ПЦР чрезвычайно чувствительна, что означает, что она может обнаруживать даже самые маленькие кусочки ДНК или РНК, но не может определить, откуда эти частицы. Это должно быть определено заранее.
И поскольку тесты ПЦР откалиброваны по последовательностям генов (в данном случае последовательностям РНК, поскольку SARS-CoV-2 считается РНК-вирусом), мы должны знать, что эти фрагменты генов являются частью искомого вируса. И чтобы знать это, необходимо выполнить правильное выделение и очистку предполагаемого вируса.
Поэтому мы обратились к научным группам, занимающимся соответствующими статьями, которые упоминаются в контексте SARS-CoV-2, для доказательства того, показывают ли электронно-микроскопические снимки, сделанные в их экспериментах in vitro (вне живого организма), очищенными вирусами.
Но ни одна команда не смогла ответить на этот вопрос «да».
Мы получили только ответы типа «Нет, мы не получали электронную микрофотографию, показывающую высокую степень очистки».
Мы спросили нескольких авторов исследования: «Показывают ли ваши электронные микрофотографии очищенный вирус?», Они дали следующие ответы:
Что касается упомянутых документов, ясно, что то, что показано на электронных микрофотографиях (ЭМ), является конечным результатом эксперимента, а это означает, что нет другого результата, из которого они могли бы сделать ЭМ.
То есть, если авторы этих исследований признают, что их опубликованные ЭМ не показывают очищенные частицы, то они определенно не содержат очищенных частиц, которые, как утверждается, являются вирусными. (В этом контексте следует отметить, что некоторые исследователи используют термин «выделение» в своих статьях, но описанные в них процедуры не представляют собой надлежащий процесс выделения (очистки). Следовательно, в этом контексте термин «выделение» является неправильно использованный.
Таким образом, авторы четырех основных работ начала 2020 года, в которых утверждается, что был обнаружен новый коронавирус, признают, что у них нет доказательств того, что геном вируса произошел от вирусоподобных частиц или клеточного мусора, чистого или нечистого, или частиц любого вида.
Другими словами, существование РНК SARS-CoV-2 основано на вере, а не на фактах.
Мы также связались с доктором Чарльзом Калишером, опытным вирусологом.
В 2001 году журнал Science опубликовал «горячую просьбу… к молодому поколению» от нескольких ветеранов-вирусологов, в том числе Калишера, в которой говорилось, что:
«современные методы обнаружения вирусов, такие как полимеразная цепная реакция: мало или ничего не говорят о том, как размножается вирус, какие животные его переносят, или как он вызывает болезни у людей. Это все равно что пытаться сказать, что у кого-то неприятный запах изо рта, глядя на его отпечаток пальца»
доктор Чарльз Калишер
И поэтому мы спросили доктора Калишера, знает ли он хоть одну статью, в которой SARS-CoV-2 был изолирован и, наконец, действительно очищен. Его ответ:
» Я не знаю такой публикации. Я присматривал за каждой».
доктор Чарльз Калишер
Фактически это означает, что нельзя сделать вывод о том, что последовательности генов РНК, которые ученые взяли из образцов тканей, подготовленных в упомянутых испытаниях in vitro и для которых окончательно «калибруются» тесты ПЦР, принадлежат определенному вирусу — в данном случае SARS-CoV-2.
НЕ СОБЛЮДЕНЫ ПОСТУЛАТЫ КОХА
Кроме того, нет научных доказательств того, что эти последовательности РНК являются возбудителем того, что называется COVID-19.
Чтобы установить причинную связь, так или иначе, то есть помимо выделения и очистки вируса, было бы абсолютно необходимо провести эксперимент, который удовлетворял бы четырем постулатам Коха.
Микроорганизм/вирус постоянно встречается в организме больных людей (или животных) и отсутствует у здоровых.
Микроорганизм/вирус должен быть изолирован от больного человека (или животного) и его штамм должен быть выращен в чистой культуре.
Чтобы только выделить его каждый раз нужны огромные средства.
При заражении чистой культурой микроорганизма/вируса здоровый человек (или животное) заболевает.
Кто это делал: заражал людей, да никто, это невозможно. А животные не дадут четкой картины.
Микроорганизм/вирус должен быть повторно изолирован от экспериментально заражённого человека (или животного).
Но такого эксперимента нет и не было, как недавно рассказали Эмори Деверо и Розмари Фрей.
Показательно, что ни один из ведущих немецких представителей официальной теории SARS-Cov-2 / COVID-19:
— Институт Роберта Коха (RKI), Александр С. Кекуле (Университет Галле),
Хартмут Хенгель и Ральф Бартеншлагер (Немецкое общество) по вирусологии),
вышеупомянутые Томас Лёшер, Ульрих Дирнагл (Шарите Берлин) или Георг Борнкамм (вирусолог и почетный профессор Гельмгольц-центра Мюнхена) — могли бы ответить на следующий вопрос, который им отправили:
Если частицы, которые, как утверждается, принадлежат к SARS-CoV-2, не были очищены, как вы хотите быть в этом уверены, что последовательности генов РНК этих частиц принадлежат конкретному новому вирусу?
Но мы не получили ответов до 18 июня 2020 года, после нескольких месяцев отсутствия ответа. В конце концов, мы добились этого только с помощью берлинского юриста Вивиан Фишер.
Шарите признает, что они не использовали очищенные частицы.
Вирусологи из клиники Шарите заявляют:
«РНК экстрагировали из клинических образцов с помощью системы MagNA Pure 96 (Roche, Penzberg, Германия) и из супернатантов клеточных культур с помощью мини-набора вирусной РНК (QIAGEN, Hilden, Германия)».
Между прочим, Corman et al. Документ, опубликованный 23 января 2020 года, даже не прошел надлежащего процесса рецензирования, и описанные в нем процедуры не сопровождались контролем — хотя только благодаря этим двум вещам научная работа становится действительно научной.
НЕРАЦИОНАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТОВ
Также несомненно, что мы не можем узнать уровень ложноположительных результатов ПЦР-тестов без широко распространенного тестирования людей, у которых определенно нет вируса, подтвержденного этим методом, не зависящим от теста (имеющим твердый золотой стандарт).
Поэтому неудивительно, что существует несколько работ, иллюстрирующих иррациональные результаты тестов.
Даже Ван Чен, президент Китайской академии медицинских наук, признал в феврале, что тесты ПЦР «точны только на 30–50 процентов», в то время как Син Ханг Ли из Милфордской лаборатории молекулярной диагностики 22 марта 2020 г. отправил письмо группе реагирования на коронавирус ВОЗ и Энтони С. Фаучи, заявив, что:
В социальных сетях широко сообщалось, что тест-наборы RT-qPCR [количественная ПЦР с обратной транскриптазой], используемые для обнаружения РНК SARSCoV-2 в образцах человека, дают много ложноположительных результатов и недостаточно чувствительны для выявления некоторых реальных положительных случаев. ”
Другими словами, даже если мы теоретически предположим, что эти ПЦР-тесты действительно могут обнаружить вирусную инфекцию, тесты будут практически бесполезными и вызовут только необоснованный страх среди «положительных» людей.
Все это согласуется с тем фактом, что CDC и FDA, например, признают в своих файлах, что так называемые «тесты SARS-CoV-2 RT-PCR» не подходят для диагностики SARS-CoV-2.
В «CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) в режиме реального времени RT-PCR Диагностическая панель» Файл от 30 марта 2020 года, к примеру, он говорит:
Обнаружение вирусной РНК может не указывать на наличие инфекционного вируса или на то, что 2019-nCoV является возбудителем клинических симптомов »
Этот тест не может исключить заболевания, вызванные другими бактериальными или вирусными патогенами ».
И FDA признает, что :
«положительные результаты, не исключают бактериальную инфекцию или коинфекцию другими вирусами. Обнаруженный агент может не являться определенной причиной заболевания».
ВЫСОКИЕ ЗНАЧЕНИЯ CQ ДЕЛАЮТ РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТА ЕЩЕ БОЛЕЕ БЕССМЫСЛЕННЫМИ
Другая важная проблема заключается в том, что многие тесты ПЦР имеют значение «количественной оценки цикла» (Cq) более 35 циклов, а некоторые, включая «тест Drosten PCR», даже имеют Cq 45.
Значение Cq указывает, сколько циклов репликации ДНК требуется для обнаружения реального сигнала от биологических образцов.
MIQE означает «Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени», набор руководящих принципов, которые описывают минимальную информацию, необходимую для оценки публикаций по ПЦР в реальном времени, также называемой количественной ПЦР или qPCR.
Сам изобретатель Кэри Муллис согласился, когда заявил :
Если вам нужно пройти более 40 циклов для амплификации гена с единственной копией, с вашей ПЦР что-то серьезно не так ».
Рекомендации MIQE были разработаны под эгидой Стивена А. Бустина, профессора молекулярной медицины, всемирно известного эксперта по количественной ПЦР и автора книги AZ по количественной ПЦР, которую назвали «библией количественной ПЦР
Источник: www.youtube.com