зачем в реакции комплимента нагревают сыворотку до 56 градусов

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента заключается в том, что соединение антигена с соответствующим ему антителом извлекает из свежей сыворотки и прочно удерживает (связывает) находящийся в ней комплемент. Применяется для обнаружения антител и определения природы антигенов. При отсутствии специфического сродства между антигеном и сывороткой адсорбция комплемента не происходит.
Для проведения этой реакции необходимы следующие ингредиенты:
— 3 или 5%-ная взвесь эритроцитов барана;
— гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
— комплемент в дозе, установленной титрованием; антиген, не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни его задержки, в дозе, установленной титрованием;
— испытуемая сыворотка, активированная при 56°С в течение 15–30 мин в водяной бане и разведенная 1 : 5 или 1 : 10; стерильный физиологический раствор (0,85%).
Эритроциты барана. Эритроциты барана получают накануне постановки реакции пункцией яремной вены у барана в асептических условиях при помощи канюли. Кровь собирают в стерильную банку, содержащую стеклянные бусы, которые встряхивают для дефибринирования в течение 10–15 мин. После этого кровь фильтруют через несколько слоев марли и производят трехкратное отмывание эритроцитов в физиологическом растворе на центрифуге. Последняя порция промывной жидкости должна быть бесцветной.
Для постановки реакции применяется 1–3%-ная взвесь эритроцитов, которая готовится из 1 мл осадка отмытых эритроцитов + 33 мл физиологического раствора. В холодильнике эритроциты могут сохраняться пять-шесть дней. Для более длительного хранения их отмывают в жидкости Рингер-Локка следующего состава: NaCl – 9,0 г, КСl – 0,2 г, СаСl2 – 0,2 г, NaHСО3 – 1,0 г на 1 л дистиллированной воды. Жидкость стерилизуют паром в течение 30 мин, а затем добавляют 10 г кристаллической борной кислоты. На леднике эта жидкость может храниться две-три недели.
Консервировать эритроциты можно также и формалином, добавляя к 10 мл осадка эритроцитов 1 мл раствора формалина такого состава: 4 мл 40%-ного формалина на 200 мл физиологического раствора.
Гемолитическая сыворотка. Для получения гемолитической сыворотки кроликам внутривенно вводят три-четыре раза 50%-ную взвесь бараньих эритроцитов по 2–5 млн. с интервалами в два-три дня. На шестой-седьмой день после окончания иммунизации проверяют титр сыворотки. Если он не ниже 1 : 1200, у животного берут кровь из сердца или из краевой вены уха. После инактивации на водяной бане при 55° С в течение 30 мин сыворотку консервируют с добавлением к ней 1 % сухой борной кислоты. Для консервирования сыворотки можно применять равный объем стерильного глицерина, прогретого при 180° С в течение 15 мин или добавлять 1 мл смеси на 9 мл сыворотки такого состава – карболовой кислоты 5,5 мл + глицерина 20 мл +74,5 мл дистиллированной воды. Можно использовать также 0,05%-ный хинозол. Сыворотку надо хранить в запаянных пробирках на леднике.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме.

Источник

Зачем в реакции комплимента нагревают сыворотку до 56 градусов

Реакция связывания комплемента (РСК) применяется для обнаружения антител в сыворотке крови или для выявления антигена в материале от больного. Эта реакция основана на том, что при взаимодействии антигена с антителом образуется комплекс, который адсорбирует (связывает) комплемент. Однако этот феномен протекает в пробирке без видимых проявлений. Для выявления результатов реакции в качестве индикаторной системы используют реакцию гемолиза. Таким образом, в РСК задействованы две системы: специфическая, в которой определяют возможность образования иммунного комплекса антитело + антиген + комплемент, и индикаторная—гемолитическая система, которая включает эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Проведение реакции делится на две фазы. В первую фазу проводят раздельную инкубацию специфического и индикаторного комплексов. Во вторую фазу смешивают указанные комплексы, что позволяет определить локализацию комплемента по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов. Так, если имеет место соответствие антигена и антитела, происходит связывание этим комплексом комплемента, а реакция гемолиза будет отрицательной, так как в системе отсутствует свободный комплемент. Если же соответствия между антигеном и антителом нет, комплемент свяжется с гемолитической системой, результатом чего будет гемолиз эритроцитов.

РСК широко применяется в диагностике инфекционных болезней — сыпного тифа, туберкулеза, сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде— Жангу), протозойных и вирусных инфекциях.

Для постановки реакции необходимы:
— исследуемая сыворотка, полученная путем венепункции;
— антиген;
— комплемент;
— эритроциты барана;
— гемолитическая сыворотка.

Подготовка ингредиентов для постановки РСК:

1. Сыворотку крови, полученную от больного путем венепункции, перед исследованием инактивируют прогреванием на водяной бане (в инактиваторе) при 56 °С в течение 30 мин. Перед постановкой реакции сыворотку разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:5 (0,1 мл сыворотки + 0,4 мл изотонического раствора).

2. Антигеном могут быть взвесь целых бактериальных клеток в дистиллированной воде или изотоническом растворе натрия хлорида, убитых нагреванием при 60 °С в течение 1 ч или при 100 °С в течение 15-20 мин, микробные полисахариды и белки, лизаты и экстракты из микробных культур, патологически измененных и нормальных тканей.

Предварительно определяют титр антигена для исключения его антикомпле-ментарности и гемотоксичности. Для этого готовят основное разведение антигена, содержащее 1 млрд, микробных тел в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида (по оптическому стандарту мутности). В ряд пробирок вносят несколько последовательно уменьшающихся доз основного разведения антигена от 0,5 до 0,05 мл, добавляют до 1 мл изотонический раствор и по 0,5 мл рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37 °С в течение 1 ч. После этого во все пробирки вносят по 1 мл смеси гемолитической системы (гемолитической сыворотки + эритроциты барана). Выдерживают 1 ч в термостате при той же температуре и проводят учет результатов.

Титром антигена считают наименьшую дозу, при которой прекращается задержка гемолиза и, следовательно, отсутствует его антикомплементарное действие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составляющую примерно 0,5-0,75 его титра.

3. Комплементом является смесь нативных сывороток, полученных от 3-5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах. Перед постановкой РСК комплемент титруют для определения наименьшего его количества (титр комплемента), которое вызывает гемолиз 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре.

Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 (0,1 мл комплемента + 0,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) и разливают в ряд пробирок в объеме от 0,05 до 0,5 мл. Доводят общий объем в пробирках изотоническим раствором до 1,5 мл и инкубируют в термостате при 37 °С в течение 45 мин. Затем добавляют в каждую пробирку гемолитическую смесь (0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре + 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана) в объеме 1 мл. Ставят 2 контроля:
— контроль гемолитической системы—1 мл гемолитической смеси + 1,5 мл изотонического раствора;
— контроль комплемента—0,5 мл основного разведения комплемента 1:10 + 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов + 1,5 мл изотонического раствора.

Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат на 30 мин. Определяют титр комплемента — минимальное количество, при котором еще происходит полный гемолиз эритроцитов.

При постановке РСК пользуются рабочей дозой комплемента, которая соответствует титру, увеличенному на 20-30% (это соответствует количеству комплемента в предпоследней пробирке (гемолиз).

Ниже приводится схема расчета приготовления рабочего раствора комплемента.

Пример. Рабочая доза комплемента равна 0,25 мл. Это значит, что в 0,25 мл основного разведения комплемента (1:10) содержится 0,025 мл нативной сыворотки морской свинки. Для постановки реакции, рассчитанной на 60 пробирок, требуется нативной сыворотки:

0,025 мл х 60 пробирок = 1,5 мл сыворотки

Это количество сыворотки разводят в 30 мл изотонического раствора натрия хлорида и разливают по 0,5 мл в опытные пробирки.

4. Гемолитическую сыворотку инактивируют прогреванием при 56 °С в течение 30 мин и используют в реакциях в тройном титре. Например, если титр такой сыворотки равен 1:1800, то в реакции используют разведение 1:600.

5. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови здорового животного в возрасте не менее 1 года. Эритроциты трижды отмывают в изотоническом растворе натрия хлорида с центрифугированием. При последнем промывании эритроцитов надосадочный слой жидкости должен быть совершенно прозрачным. К 3 мл отмытых эритроцитов добавляют 97 мл изотонического раствора и получают 3% взвесь, которую используют в реакциях.

Смесь равных объемов гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана называют гемолитической системой. Перед использованием ее выдерживают в термостате 30 мин.

Постановка диагностической РСК. Реакцию ставят в общем объеме 2,5 мл. Это соответствует количеству каждого ингредиента в дозе 0,5 мл. Рабочая доза каждого оттитрованного ингредиента содержится в объеме 0,5 мл. Реакция проводится в две фазы, каждая из которых — самостоятельная иммунологическая реакция.

Первая фаза. В одной пробирке смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки, антигена и комплемента в рабочих дозах, в другую — помещают 1 мл гемолитической смеси. Ставят 2 контроля:

— контроль комплемента (I) — исследуемая сыворотка + комплемент + изотонический раствор;

— контроль антигена (II) — антиген + комплемент + изотонический раствор.

Все пробирки выдерживают при 37 °С 1 ч или при комнатной температуре 18-20 ч.

Вторая фаза. В первую пробирку с основными компонентами реакции и в контрольные пробирки добавляют гемолитическую систему. Смесь всех компонентов реакции после энергичного встряхивания выдерживают в термостате 1 ч при тех же условиях.

Проводят учет результатов. В контрольных пробирках должно наблюдаться явление гемолиза, так как комплемент не был связан компонентами первой фазы. В опытной пробирке при соответствии антитела антигену происходит связывание комплемента и, следовательно, регистрируется задержка гемолиза.

Степень интенсивности реакции оценивают по четырехплюсовой системе:

++++ полная задержка гемолиза; жидкость бесцветна, значительный осадок эритроцитов;

+++ явная задержка гемолиза; жидкость слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов;

++ частичная задержка гемолиза; жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов;

+ слабая задержка гемолиза; жидкость интенсивно окрашена, осадок эритроцитов небольшой;

± следы задержки, почти полный гемолиз; осадок в виде облачка; полный гемолиз, «лаковая» кровь, отсутствие осадка.

Чувствительность РСК может быть повышена, если ее проводить не при 37 °С, а на холоду (при 4 °С в течение 18 ч).

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 19.08.2019

Источник

Реакция связывания комплемента механизм компоненты применение

Реакция связывания комплемента. Описание, применение

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и ATсоответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Протекание реакции

Реакция протекает в две фазы с участием двух систем; бактериальной и гемолитической. В первой реакции (специфическая) участвуют антиген 4-+ антитело + комплемент. Положительный результат реакции, наступающий при соответствии антител антигену, характеризуется образованием специфического бактериального комплекса антиген — антитело с адсорбированным, или, как говорят, «связанным», комплементом. Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался. Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением свободного активного комплемента. Первая фаза РСК может проводиться в термостате при 37°С (1—2 ч) или в холодильнике при 3—4°С (18—20 ч).

При длительном образовании иммунного комплекса антиген-антитело на холоду происходит более полное связывание комплемента и вследствие этого чувствительность реакции увеличивается. При постановке сравнительных опытов советским иммунологом акад. В. И. Иоффе и его учениками было показано, что в условиях длительного связывания комплемента на холоду можно уловить в 100—500 раз меньшие количества антигена и получить положительные результаты при больших разведениях иммунной сыворотки, чем в опыте связывания комплемента при температуре 37 °С в течение 1—2 ч. Вторая фаза реакции (индикаторная) происходит между реагентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 °С только при наличии комплемента, оставшегося свободным от первой фазы реакции (реакция отрицательная). При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не наступает (реакция положительная).

Компоненты

Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.

Механизм реакции

РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.

Применение

Реакцию связывания комплемента можно применять для:
1) выявления специфических антител в неизвестной сыворотке на основании взаимодействия их с антигеном известной природы;
2) изучения свойств антигена в реакции с известной специфической сывороткой. Подготовка ингредиентов для постановки РСК.

1. Сыворотку крови, полученную для исследования, накануне постановки реакции прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Инактивированная сыворотка может храниться при температуре 3—4°С в течение 5—6 дней. В день постановки-опыта сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:5 (0,1 мл исследуемой сыворотки,+ 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия).

2. Антигеном для постановки РСК могут быть культуры разнообразных микробов, бактериальные белки и экстракты, полученные из микробных культур, патологически измененных и нормальных органов и тканей. Особенности приготовления антигена определяются характером инфекционного процесса и особенностями его возбудителя.

3. Комплементом является смесь сывороток, полученная от 3—5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах.

Непосредственно перед употреблением сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида «атрия в отношении 1 : 10, получая основной раствор.

4. Гемолитическую сыворотку перед постанов кой опыта инактивируют прогреванием при температуре 56 °С в течение 30 мин. Для постановки основного опыта РСК, а также для титрования комплемента и антигена применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1800, в реакции применя ют разведение сыворотки 1 : 600.

5. Эритроциты получают из дефибринированной кро ви барана. Кровь для удаления пленок фибрина фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Полученный фильтрат центрифугируют, сыворотку отсасывают и сливают, а эритро циты промывают 3—4-кратным центрифугированием с изото — «ическим раствором хлорида натрия. При последнем промы вании эритроцитов надосадочный слой жидкости должен быть совершенно прозрачным. Из отмытых эритроцитов готовят 3% взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия. Подготовив указанным выше способом ингредиенты, участвующие в РСК, приступают к титрованию гемолитической сыворотки, комплемента и антигена.

Схема постановки основного опыта РСК

Примечание: * — гемолитическую систему готовят, смешивая в равных количествах гемолитическую сыворотку в тройном титре и 3% взвесь эритроцитов барана; выдерживая смесь в течение часа при 37° С.

Результаты РСК предварительно учитывают после извлечения пробирок из термостата и окончательно – спустя 15-18 ч после пребывания их при комнатной температуре или в холодильнике.

Интенсивность реакции выражают плюсами:

++++ — реакция резко положительная, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (эритроциты оседают на дно, жидкость бесцветная);

+++ — реакция положительная, характеризующаяся частичным гемолизом (лизировано

25% эритроцитов, осадок меньше, жидкость розовая);

++ — реакция положительная, характеризующаяся гемолизом (лизировано

50% эритроцитов, осадок небольшой, жидкость розовая);

+ — реакция сомнительная (лизировано

75% эритроцитов, незначительный осадок, жидкость интенсивно окрашен1.;

_ — реакция отрицательная (лизированы все эритроциты, жидкость интенсивно окрашена и прозрачна – лаковая кровь).

Достоверность результатов подтверждается контролями ингредиентов.

Заполните дома таблицу 2.

С – сыворотка; А – антиген; К – комплемент; Г – гемолитическая сыворотка;

Э – эритроциты; ГС – гемолитическая система.

Оценка результатов:положительная реакция с интенсивностью не меньше ++ при достоверных контролях свидетельствует о наличии антител и серологическом подтверждении клинического диагноза; отрицательная реакция при достоверных контролях свидетельствует о том, что антитела не выявлены и серологически клинический диагноз не подтвержден.

РСК используется, помимо диагностики хронической гонорее, при риккетсиозах, вирусных и других инфекциях.

2.Учтите и оцените результаты РИФ (прямой) с исследуемым материалом (отделяемое карбункула) и люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой.

Постановка: готовится фиксированный препарат-мазок из исследуемого материала, на который наносится люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка, содержащая антитела к бациллам сибирской язвы, меченные флюоресцентным красителем (ФИТЦ – флюоресцеина изотиоцианат).

Препарат помещают во влажную камеру, инкубируют 30 мин при 37°С, после чего его промывают водой и высушивают. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, позволяющего освещать препарат ультрафиолетом, что заставляет флюорохром светиться.

Критерии учета и оценки:при положительной РИФ – в результате соединения специфических антител, меченых флюорохромом, с антигенами микробных клеток в препарате выявляют светящиеся микроорганизмы, сходные по морфологии, размерам и взаимному расположению с предполагаемым возбудителем.

Бациллы сибирской язвы – это крупные палочки длиной до 7-8 мкм, с обрубленными концами, располагающиеся в патологическом материале короткими цепочками, парами или одиночно.

3.Учтите и оцените результаты ИФА с сыворотками доноров на ВИЧ-инфекцию.

Постановка: для определения специфических антител используют специальные панели из полистирола, в лунках которых фиксирован инактивированный вирус или его антигены. В лунки вносят сыворотки обследуемых и инкубируют.

При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием буферным раствором.

Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные пероксидазой. Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то на данном этапе они, выступая в качестве антигена, прореагируют с меченными античеловеческими антителами. Добавление после отмывки субстрата (ортофенилендиамина – ОФ5.

позволяет учесть результаты реакции. Образование продукта, окрашенного в желто-коричневый цвет, оценивается как положительная реакция.

Критерием достоверности являются контроли: с сывороткой, заведомо содержащей антиВИЧ — ИФА «+» и сывороткой, заведомо не содержащей антиВИЧ — ИФА «-».

Для проведения ИФА широко используют 96-луночные полистироловые планшеты, т.

к. на полистироле легко адсорбируются антитела, а после специальной обработки – различные антигены. Для работы с этими планшетами используются многоканальные автоматические пипетки, позволяющие вносить ингредиенты одновременно в несколько лунок панели, а также автоматические и полуавтоматические устройства для промывания лунок.

Существуют и специальные автоматы, позволяющие осуществлять все эти этапы ИФА практически без участия человека.

4. Ознакомиться и описать в таблице: антиген для реакции Вассермана, диагностические сыворотки для РСК, диагностикумы для РСК; люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка (ФИТЦ), тест-система иммуноферментная для определения антител к ВИЧ.

5.4. Итоговый контроль знаний:

— вопросы для самоконтроля:

Цель прогревания (56° 30 мин.) сывороток, используемых в РСК.

2. Методика постановки ИФА с целью определения специфических антител.

Методика постановки ИФА с целью определения специфического антигена.

4. Методика постановки РИФ с целью экспресс-диагностики заболеваний.

5. Назовите отличие непрямой РИФ от прямой и ее преимущества при определении специфических антигенов.

-решение ситуационных задач.

ЗАДАЧА №1. При постанове РСК с сывороткой обследуемого с клиническим диагнозом «коклюш» в контроле гемолитической системы наблюдается задержка гемолиза.

Если нет, то почему?

ЗАДАЧА №2. При постановке РСК с сывороткой обследуемого с клиническим диагнозом «бруцеллез» получены следующие результаты: реакция достоверна по контролям, в опыте задержка гемолиза.

ЗАДАЧА №3. С материалом от обследуемой К. с клиническим диагнозом «урогенитальный хламидиоз» была поставлена РИФ.

ЗАДАЧА №4. В родильный дом поступила беременная женщина, у которой при исследовании сыворотки крови был определен маркер вируса гепатита B.

ЗАДАЧА №5. В анонимный кабинет обратился гражданин К. с просьбой проверить его на инфицирование ВИЧ.

В процедурном кабинете у гражданина К. была взята кровь.

6. Домашнее задание для уяснения темы занятия.

Занятие № 11 Иммунопрофилактика, иммунотерапия инфекционных заболеваний.

Контрольное занятие: Инфекция, иммунитет, аллергия.

7. Список тем по НИРС, предлагаемый кафедрой:

8. Рекомендуемая литература по теме занятия:

Поздеев, О. К. Медицинская микробиология: учеб. пособие / О.К. Поздеев – М.: ГЭОТАР-Медиа,2008. – 768 с.

1. Ярилин, А.А. Иммунология: учебник / А.А. Ярилин – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 с.

Реакция связывания комплемента (РСК) отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:

РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система, выявляющая результат реакции.

РСК проводится в два этапа при участии двух систем:

В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.

Комплемент. В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т.

к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.

Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.

Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана.

Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу.

Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.

Реакция связывания комплемента Борде-Жангу

Реакция ставится для диагностики хронической гонореи с целью обнаружения антител к гонококку.

В РСК участвуют 2 системы:

Если в первой системе образуются специфический комплекс антиген + антитело, то комплемент адсорбируется (соединяется с этим комплексом) и гемолиза во второй системе не происходит.

Для реакции требуется:

После свёртывания крови сыворотка отсасывается в отдельную пробирку и инактивируется 30 минут при 56 °С на водяной бане.

Их отмывают, центрифугируя 3 раза с новыми порциями физиологического раствора. В реакции используют 3 %-ю взвесь эритроцитов.

Из сердца морской свинки шприцем насасывается кровь, после свёртывания отделяется сыворотка. Перед опытом вытитровывается рабочая доза комплемента. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 и разливают его по пробиркам от 0.1 до 0,5, после чего объем в каждой пробирке доводят физиологическим раствором до 1,5 мл.

Оба ингредиента в разных объемах и выдерживают в термостате 30 минут (сенсибилизация смеси), после чего смесь добавляют по 1 мл в пробирки и помещают в термостат на 30 минут. Контролем служат 2 пробирки:
1. 1 мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора;
2. 0,5 мл комплемента 1:10 + 0,5 мл взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора.

Титром комплемента называется его минимальное количество, при котором ещё происходит гемолиз.

Для постановки реакции берут рабочую дозу комплемента, увеличенную против титра на 20-25 %, т.е., обычно то количество комплемента, которое имеется в предпоследней пробирке с гемолизом.

Увеличение дозы комплемента необходимо потому, что в реакции активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами реакции (антиген, сыворотка).

Постановка основного опыта РСК Борде-Жангу

Вначале в 2 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 1-ю пробирку приливается антиген, во вторую — физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляется рабочая доза комплемента.

После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 °С на 30 минут (горячее связывание).

Реакция связывания комплемента, методы постановки, механизм и использование ее в бактериологии

При холодном связывании штатив с пробирками помещается в ледник при температуре — 4 «С на 18 часов. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система.

Реакция ставится в объёме 0,5 мл. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, после чего производится предварительная регистрация результатов. Пробирки остаются при комнатной температуре, а на следующий день отмечается окончательный результат.

Реакция связывания комплемента (РСК)за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорб­цией (связыванием) комплемента.

Поскольку процесс связыва­ния комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О.Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), кото­рая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемоли­за не происходит.

Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к слож­ным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологи­чески измененных и нормальных органов, тканевых липидов, ви­русы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыво­ротку морской свинки.

Механизм.

РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная.

Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — ан-тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Механизм. Способы постановки,
применение.

В основе этой реакции лежит способность специфической ан­титоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувст­вительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т.е. их нейтрализацией.

Реакцию нейтрализации(РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микро­организмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализу­ющем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о спе­цифичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

Для прове­дения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свин­кам, мышам).

Контрольным животным вводят фильтрат исследу­емого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сыво­роткой, животные опытной группы останутся живыми. Конт­рольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.

Источник